Mjerenje električnog otpora molekule – za otkrivanje toksina

Znanstvenici su, eto, napravili najmanju žicu - kraću od milijuntinke milimetra. Štoviše, uspjeli su je rastegnuti te joj izmjeriti električni otpor... Žica se zove hibrid molekula DNA i RNA, ili kraće RNA:DNA.

Nenad Raos nedjelja, 25. studenog 2018. u 07:00

Centralna dogma ili bolje ,„hrvatskije“, rečeno temeljno učenje molekularne biologije je jednostavna:  DNA → mRNA → protein. Što to znači? To znači da se geni, zapisani u molekuli DNA, pojedinačno kopiraju na molekule mRNA koje opet služe kao kalupi za sintezu proteina. Drugim riječima, redoslijedu monomernih jedinica (nukleotida) u molekuli DNA odgovara redoslijed nukleotida u molekuli mRNA, a ovaj opet redoslijedu aminokiselinskih ostataka u molekuli proteina.

Ova jednostavna shema ima dalekosežne posljedice. Prva je da svaki protein ima svoj gen (segment molekule DNA) i svoju mRNA, pa se prema specifičnoj molekuli mRNA može vidjeti ima li u stanici „njezinog“ proteina. S druge pak strane, dvostruka uzvojnica molekule DNA može nastati i hibridno, naime tako da jedna uzvojnica pripada molekuli DNA, a druga odgovarajućoj (komplementarnoj) molekuli mRNA. Molekula DNA može stoga poslužiti za identifikaciju molekule mRNA, a preko nje i proteina koji ona kodira.

I tu počinje naša priča. Američki i europski (nizozemski i turski) znanstvenici nedavno su, u broju od 5. studenoga 2018.,  časopisa Nature Nanotechnology objavili znanstveni rad u kojem su pokazali kako se može identificirati mRNA metodom čiji se princip može nazrijeti već iz naslova njihova rada: „Detection and identification of genetic material via single-molecule conductance“ (Detekcija i identifikacija genskog materijala mjerenjem vodljivosti pojedine molekule). O čemu je tu riječ?

Metoda je posve jednostavna – barem u načelu. Na krajeve segmenta molekule DNA, točnije jedne njezine uzvojnice,  kemijski se vežu sulfhidrilne skupine: –SH. Svrha te kemijske modifikacije je u tome što se sumpor rado veže za zlato, pa kad se u otopinu stave dvije mikroskopske zlatne elektrode, razmak između njih će premostiti molekula DNA. Za tu molekulu, molekulu DNA, potom se veže molekula mRNA, po načelu sparivanja nukleotidnih baza. (U molekuli DNA baze se sparuju prema ključu C-G, A-T, a u hibridu RNA:DNA  prema  ključu C-G, A-U). Elektrode se potom spoje na strujni krug te se mjeri električni otpor (točnije: njegova recipročna vrijednost, tj. električna vodljivost) u ovisnosti o razmaku elektroda.  U pokusima u rečenome članku hibrid  RNA:DNA  je imao 15 parova baza, pa je njegova početna dužina iznosila oko 0,4 nm, no ova nadasve fina žica (Au-RNA:DNA-Au) mogla se razvući bez pucanja do dvostruko veće dužine, oko jednog nanometra (milijuntinke milimetra).

Kada se elekrode razmiču vodljivost se, razumije se, smanjuje. To je najbolje vidi u slučaju kada elektrode nisu bile ničime premoštene nego se između njih nalazila samo puferirana otopina (buffer). U tom slučaju vodljivost je kontinuirano i naglo padala.  No ako je za elektrode vezan hibrid DNA:RNA dijagram električne vodljivosti prema razmaku elektroda neće biti tako jednostavan. Dobit će se složena krivulja koja će ovisiti o tome s kakvom se molekulom RNA sparila molekula DNA. Variranjem triju parova (C-Z, A-Y i T-X) znanstvenici su dobili različitu kvalitetu vezivanja uzvojnica, od sasvim dobrog, kanonskog (X = A, Y = U, Z = G) do slabog, krivog sparivanja: T-G (X = G) i A-C (Y = C ili Z = A). Štoviše, bilo je moguće istodobno detektirati dva segmenta mRNA (u našem primjeru E. coli O175:H28 i E. coli O157:H7) u istoj otopini iz histograma konstruiranog iz mnogih uzastopnih mjerenja električne vodljivosti. 

I sada, na kraju, čemu sve to služi ili – točnije – zašto su znanstvenici izabrali baš te sekvencije DNA i RNA? Riječ je o segmentu molekula mRNA iz poznate bakterije E. coli, punim imenom Escherichia coli,  koja normalno živi u crijevima i nikome ne smeta, dapače svakome koristi (sudjeluje u sintezi vitamina B i K te sprječava truljenje). No neki sojevi te bakterije mogu biti opasni jer sadrže Shiga-toksine, Stx, koji se opet dijele u dvije skupine, Stx1 i Stx2. Ti toksni izazivaju proljeve, posebice kod djece, a mogu biti opasni i za bubrege. I kako vidjeti sadrže li ih bakterije E. coli ili ne sadrže?

Odgovor na to pitanje trebala bi dati upravo spomenuta analiza, jer ona prepoznaje molekule mRNA odgovorne za sintezu Shiga-toksina. Kako sada stvari stoje analiza može detektirati opasnu mRNA i u atomolarnim (aM) koncentracijama, dakle u koncentracijama reda veličine 10-18 mol/L, a to znači tek nekoliko stotina molekula u mililitru!

No tu priča ne staje, jer se opisana analitička metoda  može uporijebiti i za mnoge druge svrhe, ne samo za otkrivanje opasnih sojeva bakterije E. coli. Njome bi se moglo otkriti nastajanje bilo kojeg proteina u stanici, a mogla bi detektirati i viruse, budući da mnogi od njih ne prenose gensku informaciju molekulom DNA, nego molekulom RNA. Skupini tih virusa, RNA- virusa, pripada i uzročnik side - zloglasni HIV.

 

Nenad Raos, rođen 1951. u Zagrebu, je doktor prirodnih znanosti iz područja kemije, znanstveni savjetnik u trajnome zvanju. Do umirovljenja radio je u zagrebačkom Institutu za medicinska istraživanja i medicinu rada (IMI)  baveći se bioanorganskom i teorijskom (računalnom) kemijom. Još od studentskih dana bavi se popularizacijom znanosti surađujući u mnogim časopisima i revijama (Priroda, ABC tehnike, Čovjek i svemir, Modra lasta, Smib, Fokus). Napisao je više od dvije tisuće znanstveno-popularnih članaka, 13 znanstveno-popularnih knjiga te u koautorstvu dva sveučilišna udžbenika iz područja dizajniranja lijekova. Sada piše za mrežne stranice  Zg-magazina te za časopis Čovjek i svemir te, naravno, za BUG online. U časopisu Kemija u industriji je stalni komentator te  urednik rubrike „Kemija u nastavi“. Godine 2003. dodijeljena mu je Državna godišnja nagrada za promidžbu i popularizaciju znanosti.