Od trenutka kad je 2012. godine objavljeno da bakterijski imunosni sustav može biti pretvoren u univerzalni alat za rezanje i prepravljanje gena, znanstvena zajednica diše na škrge od uzbuđenja. CRISPR-Cas9 je otvorio vrata do tada nezamislivim zahvatima: jednostavnom, relativno jeftinom i preciznom mijenjanju DNK u gotovo svakom organizmu.

Genetika između skalpela i pincete

Ono što je prije izgledalo kao daleka znanstvena fantastika – popravljanje pogrešaka u genomu, brisanje neželjenih gena i dodavanje korisnih – odjednom se našlo na dohvat ruke u gotovo svakom laboratoriju na planetu. Ta nagla dostupnost izazvala je i svojevrsni kulturni šok u znanstvenoj zajednici: ono što je nekad bilo rezervirano za specijalizirane centre sada je postalo svakodnevni alat i u manjim laboratorijima, a rasprave o potencijalu ubrzo su prerasle u rasprave o ograničenjima i opasnostima.

Ali, kako to obično biva, što je moć veća, to je i odgovornost veća. I rizik. Uređivanje DNK znači trajnu promjenu – jednom kad se rez napravi, povratka nema. Ako se pogriješi, pogreška ostaje zapisana u genomu zauvijek, a s njom i sve posljedice za buduće stanice, tkiva pa i potomke. Upravo zbog toga su mnogi znanstvenici i etičari upozoravali da je riječ o tehnologiji koja zahtijeva krajnji oprez, jer može donijeti dobrobit, ali i izazvati nenadoknadivu štetu.

Upravo tu nastupa najnoviji iskorak istraživača s Yalea. Objava njihovog otkrića u časopisu Cell  prije par dana označava važnu prekretnicu koja nije samo laboratorijski kuriozitet, nego ozbiljna platforma za buduće terapije. Umjesto trajnog „kirurškog zahvata“ na DNK, oni nude nešto što nalikuje na privremenu operaciju: alatke koje ciljaju RNK, dakle na prijepis gena, a ne samu DNK, genetski „hard disk“. Takva strategija omogućuje da se genetska informacija nakratko izmijeni, a zatim se, prirodnim obnavljanjem molekula, vrati u izvorno stanje. Promjena je jednako učinkovita, ali nestaje s vremenom, jer RNK u stanici prirodno ima kratak vijek i ne prenosi se dalje u iduće generacije stanica.

Podsjetnik: zašto je CRISPR zavrijedio Nobela?

Vrijedi se ovdje nakratko zaustaviti. Često se o CRISPR-u piše kao o „molekularnim škarama“, što je zgodna metafora, ali ne daje punu sliku. Da bismo razumjeli značaj novog otkrića, treba se prisjetiti kako je CRISPR uopće postao sinonim za biološku revoluciju.

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) izvorno je bakterijski imunosni sustav. Bakterije, kad ih napadne virus, „pamte“ njegove dijelove i pohranjuju ih u obliku kratkih sekvenci DNK. Te sekvence služe kao vodič – kad se isti virus opet pojavi, bakterija proizvede RNK koja ga prepoznaje i aktivira protein Cas (najčešće Cas9), koji reže uljeza na točno određenom mjestu.

Znanstvenici su shvatili da se taj mehanizam može iskoristiti i za ciljanje bilo koje druge DNK sekvence. Dovoljno je programirati vodič-RNK, spariti ga s Cas9 proteinom i sustav će otići točno na željeno mjesto u genomu i napraviti rez. Potom stanični mehanizmi popravka mogu zalijepiti rez ili umetnuti novu sekvencu.

Time je nastao alat koji je jednostavan, brz i jeftin. U usporedbi s prijašnjim metodama genske manipulacije, CRISPR je donio skok kao da s korištenja kamene sjekire prijeđete na laserski skalpel.

Zbog tog otkrića Emmanuelle Charpentier i Jennifer Doudna dobile su 2020. Nobelovu nagradu za kemiju. Nije to bila samo nagrada za tehničku inovaciju, nego i priznanje da se medicina, biologija i biotehnologija nalaze pred radikalnom prekretnicom.

Zašto je CRISPR tako važan?

CRISPR je važan jer omogućuje precizno ciljane promjene u genomu, a istodobno je jednostavniji i pristupačniji od ranijih tehnika poput ZFN-a ili TALEN-a. Osim toga, njegova snaga proizlazi iz fleksibilnosti: primjenjuje se u bakterijama, biljkama, životinjama i ljudskim stanicama, pa je postao univerzalni alat u rukama molekularnih biologa. Upravo zato otvara prostor za liječenje genetskih bolesti na njihovu izvoru, u samoj DNK, te pokreće čitave nove industrije, od poboljšanja poljoprivrednih kultura preko razvoja novih lijekova do terapija raka i rijetkih nasljednih poremećaja. Njegova se upotreba proširila i na područja koja nisu izravno medicinska: u agronomiji se koriste genetski prilagođene biljke otpornije na sušu, u ekologiji se raspravlja o mogućnosti vraćanja izumrlih vrsta, primjerice mamuta, a u industriji se razvijaju mikroorganizmi programirani da proizvode nove materijale i biogoriva.

Međutim, s moći dolaze i problemi. Najveći među njima su takozvane off-target mutacije, koje se događaju greškom - kada se rez dogodi na krivom mjestu, kao i nepovratnost promjena - jer jednom izmijenjen genom ostaje trajno promijenjen. Tu su i složena etička pitanja, posebno kad se radi o primjeni na ljudskim embrijima ili na načinima koji bi mogli dovesti do nasljednih izmjena u čitavim populacijama. Ove zabrinutosti nisu samo teorijske – nekoliko slučajeva neodgovornih eksperimenata, među kojima je najpoznatiji pokušaj stvaranja prvih genetski izmijenjenih kineskih blizanki 2018. godine, izazvalo je globalnu osudu i dovelo do pojačanih regulatornih ograničenja. Strah od nekontroliranih posljedica stoga ide ruku pod ruku s nadom da će tehnologija donijeti iznimnu dobrobit.

Upravo zbog tih ograničenja, ali i zbog težnje da se postigne veća sigurnost i preciznost, novo otkriće s Yalea zvuči toliko privlačno.

Od DNK do RNK: zašto mijenjati strategiju?

DNK je „knjiga života“. U njoj su pohranjeni svi recepti za život, a jednom kad ih izmijenite, ta se promjena zapisuje trajno i više se ne može obrisati. RNK, s druge strane, predstavlja radne kopije tih recepata – privremene transkripte koji se koriste da stanica proizvede proteine. Te se molekule stalno stvaraju i razgrađuju, pa im je vijek vrlo kratak i neprestano se obnavljaju.

Ako umjesto DNK ciljate RNK, otvaraju se prednosti koje čine ovu strategiju mnogo sigurnijom i fleksibilnijom od klasičnog uređivanja genoma. Promjena u RNK traje samo onoliko koliko traje i sama molekula, pa se učinak prirodno gubi kada RNK nestane. Budući da stanica stalno stvara nove transkripte, može u svakom trenutku proizvesti novu, neizmijenjenu RNK i tako poništiti učinak privremenog uređivanja.

Upravo ta prolaznost znači i manji rizik, jer se izmjene ne upisuju trajno u genom i ne prenose se dalje u sljedeće generacije stanica. Takva prolaznost može biti posebno važna u kliničkom kontekstu, jer omogućuje testiranje terapijskog pristupa bez straha od trajnih posljedica, a istraživačima pruža priliku da detaljnije prouče učinke privremenog isključivanja ili popravljanja gena.

Drugim riječima, RNK-ciljane alatke omogućuju nešto poput probne vožnje u genskoj terapiji. Umjesto trajne i nepovratne operacije na genetskoj knjižnici, riječ je o privremenoj intervenciji koja ostavlja prostor za korekcije i povlačenje. Možete privremeno isključiti ili popraviti genetski zapis i zatim pratiti rezultat, bez opasnosti da ste zauvijek pogrešno zapisali kod, što ovu tehnologiju čini privlačnom ne samo za buduće terapije nego i za osnovna istraživanja mehanizama života.

Uništiti, izmijeniti ispraviti...

Tim s Yalea, predvođen Chengtaom Xuom, postdoktorskim istraživačem, i profesorom Ailongom Keom, bavio se detaljnim proučavanjem manje poznatih varijanti CRISPR sustava. Iako je Cas9 najpoznatiji član ove obitelji, u pozadini postoji čitav niz srodnih proteina, među kojima posebno mjesto zauzima IscB, čija je biološka uloga dugo bila nedovoljno istražena. Upravo je pažljivo analiziranje tih skrivenih mehanizama dovelo do iznenađujućeg otkrića da neke od tih varijanti prirodno ciljaju RNK, a ne DNK. Znanstvenici su uspjeli iskoristiti to svojstvo i pretvoriti ih u nove, posebno oblikovane alate koji su dobili nazive R-Cas9 i R-IscB.

Ovi novi enzimi pokazali su sposobnost da prepoznaju i - kao jednu od opcija - unište ciljanu molekulu mRNK, čime se privremeno isključuje funkcija određenog gena i zaustavlja sinteza proteina. Osim uništavanja postoje i druge, manje "agresivne" opcije: primjerice, R-Cas9 i R-IscB mogu izvršiti precizne izmjene unutar RNK sekvenci, što omogućuje korekciju manjih pogrešaka ili modifikaciju poruke koju nosi RNK.

Treća, možda najzanimljivija mogućnost, jest njihova sposobnost provođenja trans-splicing reakcija, procesa kojim se pogreške u RNK mogu ispraviti na način primjenjiv kod vrlo širokog raspona genetskih bolesti, pa čak i onih koje se do sada smatralo teško ili nemoguće liječiti.

Trans-splicing je postupak u kojem se dijelovi dviju različitih RNK molekula mogu spojiti kako bi nastala nova, funkcionalna RNK, čime se ispravlja pogreška u genetskoj poruci. U laboratoriju se to izvodi korištenjem posebno dizajniranih vodič-RNK i enzimskih kompleksa koji prepoznaju ciljnu sekvencu i omogućuju da se fragment pogrešne RNK zamijeni točnim dijelom, stvarajući pritom ispravan prijepis za sintezu proteina.

Kada se sve navedeno uzme u obzir, očito je da R-Cas9 i R-IscB funkcioniraju kao molekularni alati za "privremenu genetsku kirurgiju", pružajući istraživačima mogućnost intervencije koja je snažna i precizna, ali istodobno prolazna i reverzibilna.

Sigurnosni iskorak

Glavni razlog zbog kojega se ovaj novi pristup smatra izuzetno važnim jest prije svega sigurnost. Dok uređivanje DNK nosi trajne posljedice i često teško kontrolirane nuspojave koje se mogu prenositi i na iduće generacije stanica, uređivanje RNK nudi sasvim drugačiju dinamiku. Ono omogućuje terapiju koja traje samo onoliko dugo koliko molekule RNK postoje u stanici, što u praksi znači da učinak traje od nekoliko sati do nekoliko dana, nakon čega se sustav vraća u ravnotežu.

Ova privremenost otvara različite mogućnosti primjene. Primjerice, u slučaju rijetkih nasljednih bolesti, defektni protein mogao bi se barem na određeno vrijeme ispraviti, a pacijentu bi se omogućilo normalno funkcioniranje dok traje djelovanje terapije. Slično tomu, kod složenijih stanja gdje nije preporučljivo trajno mijenjati genom – poput određenih neuroloških ili imunoloških poremećaja – privremeno ciljano djelovanje na razini RNK može donijeti terapijsku korist bez rizika od nepovratnih promjena u DNK. Na kraju, u istraživačkom laboratoriju ovakva tehnologija nudi jedinstvenu priliku da se geni privremeno gase ili pale, kako bi se u kontroliranim uvjetima preciznije proučila njihova funkcija i uloga u staničnim procesima.

Za medicinu je to velika prednost jer omogućuje provođenje eksperimenata i testiranje terapija uz daleko manji rizik. Može se isprobati različite strategije liječenja i promatrati njihove posljedice znajući da promjene neće biti trajne, što značajno smanjuje strah od nepovratne štete i povećava spremnost na daljnje kliničke iskorake.

Usmjeravanje prema sigurnijoj budućnosti genske terapije

Istraživači su već najavili nekoliko konkretnih smjerova kojima žele nastaviti svoje istraživanje. Kao prvo, planiraju detaljno testirati R-Cas9 i R-IscB u modelima rijetkih genetskih bolesti, kako bi se pokazalo da ove alatke uistinu mogu funkcionirati u složenom okruženju živog organizma. Nadalje, jedan od ciljeva jest razviti pouzdane metode za njihovo precizno unošenje u stanice pacijenata, jer tek kada se pronađe siguran način dostave moći će se razmišljati o kliničkim primjenama. Uz to, istraživači naglašavaju da je potrebno daljnje usavršavanje i optimizacija samih sustava, kako bi se smanjile moguće nuspojave i povećala preciznost djelovanja. Sve to pokazuje da put od laboratorijskog otkrića do terapije koja će se primjenjivati u praksi nije kratak, ali je jasno zacrtan.

Ako je CRISPR-Cas9 bio revolucija koja je omogućila ljudima da prvi put režu i lijepe vlastiti genetski kod, onda su R-Cas9 i R-IscB svojevrsna druga generacija – sofisticiraniji alati koji nude znatno veću kontrolu i dodatnu sigurnost. Umjesto trajnog reza u genomu, istraživači sada imaju mogućnost provoditi privremene i reverzibilne intervencije koje otvaraju vrata sigurnijoj i postupnijoj primjeni genske terapije. Upravo ta prolaznost mogla bi biti presudna za njezin ulazak u širu medicinsku praksu, jer se rizik smanjuje, a učinkovitost zadržava.

Stoga pitanje više nije hoće li se genska kirurgija u budućnosti primjenjivati, nego kako je učiniti što sigurnijom i odgovornijom. U tome leži najveći doprinos Yaleovih istraživača: pokazali su da se i u biotehnologiji, baš kao i u kirurgiji, ponekad vrijedi osloniti na privremeni šav umjesto na trajni rez, jer upravo takav pristup može otvoriti novu eru sigurnijih, preciznijih i etički prihvatljivijih terapija.

^{Igor „Doc“ Berecki je pedijatar-intenzivist na Odjelu intenzivnog liječenja djece Klinike za pedijatriju KBC Osijek. Pobornik teorijske i praktične primjene medicine i znanosti temeljene na dokazima, opušta se upitno ne-stresnim aktivnostima: od pisanja znanstveno-popularnih tekstova u tiskanom i online-izdanju časopisâ BUG, crtkanja računalnih i old-school grafika i dizajna, zbrinjavanja pasa i mačaka, fejsbučkog blogiranja o životnim neistinama i medicinskim istinama, sve do kuhanja upitno probavljivih craft-piva i sasvim probavljivih jela, te neprobavljivog sviranja bluesa.}