Doktor Arturo Bonilla je prošle godine u teksaškoj klinici u San Antoniju mladoj 20-godišnjoj ženi rođenoj bez uške prišio novo, lijepo uho. Nova uška je modelirana nakon skeniranja njezinog lijevoga uha kao predloška za određivanje veličine i oblika za desnu stranu. Za Bonillu, priznatog stručnjaka na tom području, pedijatrijskog kirurga koji više od 25 godina kirurški korigira i liječi prirođene anomalije uha, takav je postupak manje-više rutina. Ali...

Od jednostavnog prema slojevnom

Ali ovaj je slučaj bio umnogome poseban: po prvi puta je implantirano uho bilo proizvod 3D bioprintera koji je kao „tintu“ koristio ženine vlastite hrskavične stanice. Postupak implantacije protekao je – po riječima samoga Bonille – vrlo lako i bez ikakvih poteškoća.

No, takva je izjava daleko od istine: kada se uzme u obzir što je sve prethodilo samom činu implantacije i kakve su brojne biotehnološke inovacije ugrađene u taj završni čin estetsko-funkcionalne korekcije izgleda vanjske uške jedne mlade žene, teško da se može reći da se do takvoga postignuća stiglo lako i bez problema.

Od teme koja je nekada bila tek zabavan predmet popularne fantastike, preko prvih zametaka ideje o „štampanju živih organa“, pa sve do konkretne znanstvene i tehnološke realizacije u praksi, 3D biotisak pokazuje postupnu progresiju u svim aspektima medicinske primjene. Tempo napretka je donekle spor, ciljni datumi za neke od najambicioznijih 3D planova još uvijek su udaljeni desetljećima... ali napredak je stvaran, vidljiv – i opipljiv.

Profesor Tal Dvir, direktor Odjela tkivnog inženjerstva i regenerativne medicine na Sveučilištu Tel Aviv u Izraelu smatra da ćemo kompletne organe za transplantaciju imati na raspolaganju za desetak godina: počet ćemo s jednostavnim tkivima i organima poput kože i hrskavice, a potom ćemo prijeći na kompliciranija tkiva, da bismo naposlijetku bili sposobni pacijentu „isprintati“ novo srce, jetru ili bubreg - i to korištenjem njegovog vlastitog tkiva.

Budućnost 3D biotiska

Premda sve to zvuči fikcijski i fantastično poput čudesnih strojeva kojima se na futurističkim svemirskim brodovima regeneriraju cijeli organi i dijelovi tijela astronauta koji je netom prije u napadu militantnih aliena unakažen hicima iz pulsnih lasera, te se fantastična fikcija već događa u našoj suvremenoj stvarnosti.

Višeslojna koža, kosti, mišićne strukture, krvne žile, tkivo mrežnice oka, pa čak i kompletni mini-organi, svi su u zadnjih godinu-dvije uspješno 3D-isprintani u mnogim laboratorijima širom svijeta. Premda su ti rezultati postignuti na laboratorijskim životinjskim modelima (većinom na tkivima i organima štakora i svinja), ipak nijedan od tih printanih „proizvoda“ sve donedavno nije bio odobren za upotrebu na ljudima. Međutim, žestok tempo kojim se odvija utrka u inovativnim unapređenjima 3D tiska ljudskog tkiva oduzima dah, a Bonillin uspjeh s uškama (koji predstavlja prvi 3D bioprint načinjen iz živih stanica koji je potom implantiran nazad u čovjeka), označava prijelomni trenutak te utrke.

Ali to nije sve! Istraživači u Poljskoj su od svinjskih stanica bioprintirali posve funkcionalan prototip gušterače u kojem je postignut stabilan protok krvi tijekom promatranog dvotjednog razdoblja, prema sažetku njihovog znanstvenog rada iz 2022. kojega je predstavio dr. Michal Wszola, kreator bioničke gušterače. Ako ste se pitali je li ta gušterača uspjela proizvoditi inzulin, odmah ćemo i odgovoriti: jeste.

Američka tvrtka United Therapeutics Corporation ispisala je 3D-repliku ljudskih pluća s 4000 kilometara kapilara i 200 milijuna alveola (sićušnih zračnih vrećica) osposobljenih za izmjenu kisika u životinjskim modelima, što je ključni korak prema stvaranju pluća pogodnih za presađivanje ljudima, s idućim ciljem da se unutar narednih pet godina pripremi legislativni teren (zakonska regulativa) za prva klinička ispitivanja takve transplantacije na ljudima.

Na Institutu za regenerativnu medicinu Sveučilišta Wake Forest znanstvenici su razvili mobilni sustav za 3D-bioprintanje kože. Predviđaju da će u ne tako dalekoj budućnosti moći dokotrljati takav prenosni 3D-biopisač izravno do kreveta pacijenta s opeklinama čije kožne rane ne zacjeljuju, pa mu na licu mjesta skenirati i izmjeriti područje rane i potom 3D ispisati kožu, sloj po sloj, izravno na površinu rane. Baš kao u znanstvenofantastičnim filmovima.

Otišlo se i korak dalje: kod štakora je izvršen uspješan 3D ispis i implantacija mišićmog tkiva noge, za koje se pokazalo da se normalno kontrahira i uspijevaj vratiti više od 80% prethodno izgubljene mišićne funkcije unutar samo osam tjedana od implantacije.

Vratimo se u spomenuti telavivski laboratorij u kojem radi profesor Dvir: u njemu je načinjeno maleno 3D-printano srce (Dvir kaže: „veličine zečjeg“), koje ne samo da je izgrađeno od živih, pravih stanica ljudskog srčanog mišića i oblikovano tako da kroz njega postoji krvni protok kroz sustav srčanih komora i glavnih krvnih žila, već ima sposobnost pravilnih ritmičnih kontrakcija, srčanih otkucaja.

Za 3D-ispis ljudskog srca u punoj veličini potrebna je posve ista osnovna tehnologija, premda je za sada proces takvog „skaliranja“ još uvijek prilično kompliciran. Ali, ide se korak po korak strpljivo naprijed. „Sada radimo na usavršavanju postupka bio-printanja provodnih (elektro-impulsnih) srčanih stanica zaduženih za precizni pace-making, odnosno za davanje normalnog fiziološkog poticaja srčanim otkucajima, kao i na definiranju različitosti u 3D-ispisu stanica srčanih pretklijetki i klijetki (atrijskih i ventrikulskih stanica), baš kao u 'pravom' srcu.", kaže Dvir. „Jeste komplicirano, ali izgleda sve bolje i bolje. Vjerujem da je ovo budućnost.“

Kako funkcionira 3D biotisak

Sposobnost 3D ispisa ljudskih organa je fascinantan koncept – i kao ideja i kao tehnološki izazov. Samo u SAD-u je trenutno preko 110.000 osoba na listama čekanja na donirane organe, a prema podacima američke savezne Uprave za zdravstvene resurse i usluge, tijekom čekanja na organ kompatibilnog donora dnevno umire 17 pacijenata s te liste. Proces 3D ispisa koji koristi pacijentove vlastite stanice za uzgoj organa ne samo da ima potencijal značajnog smanjenja te listu čekanja, već bi dramatično smanjio i šanse za odbacivanje organa i vjerojatno eliminirao potrebu za štetnim cjeloživotnim imunosupresivnim lijekovima.

Dvije su 3D-print tehnike revolucionirale tkivni inženjering: jedna je mogućnost preciznog umetanja različitih tipova stanica na točno potrebna mjesta za izgradnju složenih tkiva, a druga je mogućnost integriranja krvnih žila koje potom isporučuju kisik i hranjive tvari potrebne za održavanje isprintanih stanica i tkiva na životu. „Napredak u ovom području je tijekom posljednja dva desetljeća impresivan: neopisivo brzo se stiglo od nekadašnjeg bio-ispisa jednostavnih, jednoslojnih staničnih struktura, preko sadašnjih višeslojnih tkiva sa žilama koje se mogu spojiti na krvnu pumpu, pa sve do složenih 3D modela koji sve više nalikuju komponentama srca s posve funkcionalnim specijaliziranim srčanim stanicama“, kaže Mark Skylar-Scott, docent na Odjelu za bioinženjering Sveučilišta Stanford.

U 3D bioprintanju temelj svega su - stanice. Cjelokupan proces izrade novog tkiva ili organa započinje stvaranjem (generiranjem) stanica koje istraživači žele bioprintirati. Za to se koriste pluripotentne matične stanice (kao i za stvaranje organoida, o čemu smo nedavno također pisali na Bug On Line). Matične stanice se  u laboratoriju stimuliraju da postanu tipovi stanica specifičnih za tkiva i organe: mišićne, hrskavične, jetrene stanice... koje se zatim pretvaraju u bio-tintu, živu tintu za 3D-biopisač. Biotinta se proizvodi miješanjem živih stanica s „nosećim“ materijalima poput želatine ili alginata, kako bi dobila kašastu konzistenciju (poput paste za zube), pogodnu za protiskivanje kroz mlaznice 3D-biopisača.

Štoviše, laboratorij Sveučilišta Stanford sada istražuje načine kako bi matične stanice sâme, bez dodatka želatine i drugih aditiva, mogle prirodno formirati takvu pastoznu konzistenciju ako ih se uzgaja „nagurane“ zajedno u malom prostoru, što bi moglo omogućiti proizvodnju 3D tiskanih organa načinjenih isključivo od pacijentovih vlastitih stanica, bez pomoćnih „nosećih“ materijala.

Biotinta se puni u štrcaljke 3D pisača i istiskuje iz mlaznice „kao šlag na tortu“, opisuje Skylar-Scott. Za proces 3D bioprinta organa koji se sastoje od više tkiva (dakle od različitih vrsta stanica), svaka „stanična tinta“ se ubacuje u različitu mlaznicu, baš kao kod ink-jet pisača u boji. Potom se organ ispisuje slaganjem svakog novoga sloja na prethodni. Za ispis jednoga mini-srca kakvoga je izradio profesor Dvir, potrebno je oko 4 sata. Nakon što je ispis dovršen, novi organ se povezuje s pumpom koja kroz njega pokreće kisik i hranjive tvari, a tako oksigenirana i nahranjena tkiva su živa, pa se nadalje razvijaju sama od sebe i postaju zrelija i funkcionalnija, sve do trenutka kada u laboratorijskim uvjetima postignu veličinu i funkcionalnu zrelost potrebnu za usađivanje u živi organizam.

Pogled prema sljedećim izazovima

Iako je proces 3D ispisa organa u ovom kratkom opisu ekstremno pojednostavljen i  lišen gomile preciznih tehnoloških detalja radi lakšeg razumijevanja, to je u osnovi točno isti postupak koji je doveo do proizvodnje vanjskog dijela uha kojega je Arturo Bonilla ugradio svojoj pacijentici u Teksasu. U prethodnim operacijama korekcije prirođenih anomalija uške, Bonilla bi ručno modelirao novo uho koristeći hrskavicu operativno izvađenu s pacijentovih rebara. Umjesto toga, za 3D ispis je učinjena mala biopsija (uzimanje mikroskopskog uzorka tkiva) na pacijentovom drugom uhu, a od te male količine stanica hrskavice uzetih biopsijom uzgojene su u laboratoriju milijarde novih hrskavičnih stanica, od kojih je potom izrađena biotinta kojom je prema trodimenzionalnom modelu načinjenom pomoću skeniranja zdrave uške, bioprinterom upogonjenim svojevrsnim CNC-softverom "ispisano" novo uho.

„Kao i kod svake druge nove tehnologije i istraživanja u biološkim znanostima, bit će potrebno dosljedno ponoviti postupak i kod budućih pacijenata, kako bi se ova tehnika potvrdila, verificirala, standardizirala i usavršila“, kaže Bonilla. „Još ne možemo točno prognozirati kada će postupak 3D otiska uške vlastitim stanicama postati glavni oblik terapije takvih anomalija, ali možemo sa sigurnošću ustvrditi da će budućnost biti vrlo uzbudljiva.“

Znanstvenici na Institutu za regenerativnu medicinu Sveučilišta Wake Forest (ona ekipa koja razvija mobilni 3D bioprinter za „štampanje“ nove kože izravno na tijelo pacijenta) već godinama laboratorijski uzgajaju organe i tkiva. Osim za stvaranje nove kože, koristili su 3D printanje kako bi u laboratoriju stvorili mini-bubreg i mini-jetru. Sljedeći izazov su veće, čvrste strukture koje potpunije oponašaju rad pravih organa u prirodnoj veličini. Jennifer Lewis, profesorica bioinženjerstva na Sveučilištu Harvard koja surađuje s Wake Forestovim istraživačima, ipak tvrdi da je još dalek put do postizanja tog cilja na razini full-sized organa.

Problemi i rješenja

Osnivač Wake Forest Instituta Anthony Atala objašnjava u čemu nailaze na najveće probleme: „Uspjeli smo 3D ispisati ravne strukture poput kože, pa i cjevaste strukture poput krvnih žila ili šuplje, čak i vrećaste organe poput mjehura. Ali veći, čvrsti organi poput jetre, gušterače, srca ili pluća su drugačiji zbog problema s prehranom. Naime, ekstremno je teško u 3D-ispisanom velikom organu s milijardama živih stanica koje trebaju kisik i hranjive tvari osigurati dovoljnu vaskularizaciju, dovoljan broj velikih dovodnih i odvodnih krvnih žila i sitnih prehrambenih kapilara koje će 'pokriti' tako veliku gustoću stanica po kubnom centimetru.“

Povrh svega, kod laboratorijske proizvodnje stanica za biotintu, temeljna stavka je njihova funkcionalna kvaliteta, njihova biološka učinkovitost: znanstvenici su od matičnih stanica uspjeli stvoriti stanice srca, ali one nakon ugrađivanja u 3D-ispisano srce još uvijek ne kucaju tako snažno kao „originalne“ stanice srca. Isto vrijedi za stanice jetre (metabolizam) i stanice bubrega (filtracija krvi). Mark Skyler-Scott sa Stanforda kaže da je područje 3D bioprinta u tehnološkom smislu doseglo dovoljno visoku razinu, pa su 3D biopisači već sada vrlo sofisticirani i sposobni strojevi, ali je na neki način potrebno sačekati da i biolozi naprave nova značajna otkrića i unaprijede sâme „sirovine“ – stanice i biotintu – do razine funkcionalnosti koja će biti usporediva sa stanicama i tkivima u pravim, živim organima.

A tu je i problem količine (a i cijene). Za printanje ljudskoga srca u punoj veličini i funkcionalnosti potrebno je milijarde i milijarde stanica – i to nekoliko vrsta: vezivnih, krvožilnih, pokrovnih (endotel i epitel), pa čak i najmanje tri različite vrste stanica srčanog mišića – jedne koje generiraju impulse za ritam otkucaja, druge koje taj impuls prenose kroz srce, te naposlijetku one koje svi znamo kao srčani mišić, dakle „radne“ stanice koje se stežu i čine osnovu srčane pumpe. Da bi se proizvelo dovoljno stanica za samo jedan full-sized organ, za svaku vrstu tkiva od kojega je taj organ građen potrebno je osigurati specijalni 10-litarski kontejner s miješalicom i kompliciranim sustavom za hranjenje, što košta oko 5.000 eura dnevno po svakom kontejneru, i sve to tijekom procesa koji nekada traje mjesecima. A krajnji cilj nije 3D ispis samo jednoga, nego nekoliko tisuća organa mjesečno. Uz samo malo računanja jasno je da je tehnologija takve vrste još uvijek enormno financijski zahtjevna i komercijalno neisplativa.

Osim svega toga, tu je pitanje kako će se 3D-ispisano tkivo integrirati u tijelo i kako će ga tijelo prihvatiti, uključujući složene mreže krvnih žila, živaca i više drugih tipova stanica koji nakon usađivanja tek trebaju iz tijela urasti u implantat i učiniti ga živim, funkcionalnim dijelom organizma. „Ne znači da se to ne može“, kaže Dan Cohen, izvršni direktor i suosnivač tvrtke 3D Bio Terapeutika, koji je počeo raditi na području biotiska prije 20 godina, kada još nije ni imalo službeni naziv. „Sve se može i mora riješiti. Imam puno optimizma u pogledu budućnosti 3D biotiska i regenerativne medicine općenito.“

Doktore, isprintaj mi novu jetru i novi nos!

Unatoč navedenim poteškoćama, napredak 3D ispisa je jasno vidljiv, čak i kada ne govorimo samo o ispisivanju cijelih organa namijenjenih transplantaciji. Primjerice, istraživači s Harvarda su iz ljudskih pluripotentnih matičnih stanica generirali srčane stanice, a zatim ih nasadili na bioinžinjerski čip s integriranim senzorima koji mogu pratiti mikroelektrične potencijale i kontrakcije, stezanje mišića koji predstavljaju otkucaje srčanog tkiva. Ovo 3D-ispisano „srce na čipu“ može se koristiti za testiranje različitih kardioloških lijekova na potencijalno toksične nuspojave i može smanjiti potrebu za testiranjem na životinjama ili ljudima. Slična „ALS-on-a-chip“ tehnologija koristi se za ispitivanje kemijskih spojeva - kandidata za lijekove i za bolje razumijevanje temeljnih mehanizama ALS-a, amiotrofične lateralne skleroze, mišićne bolesti od koje je primjerice bolovao Stephen Hawking.

„3D printer vam daje nekoliko prednosti“, kaže Anthony Atala iz Wake Foresta. “Prvi je količinsko skaliranje, jer umjesto da tkiva i organe izrađujete ručno jedan po jedan, pisač to učini automatizirano. Druga prednost je preciznost: možemo znatno točnije smjestiti tkiva i stanice tamo gdje su u organu najpotrebnije. Treća prednost je reproducibilnost, ili jednostavnije rečeno: niži ukupni troškovi, budući da 3D ispis omogućuje proizvodnju iste strukture uvijek iznova. I četvrta, možda i najbitnija je biokompatibilnost, odnosno činjenica da je novi organ napravljen od pacijentovih vlastitih stanica, što odbacivanje transplantiranog organa čini mnogo manje vjerojatnim.“

Danas većina stručnjaka smatra da je transplantacija ljudskih 3D-ispisanih organa u prirodnoj veličini i funkcionalnosti udaljena od sadašnjeg vremena negdje između 20 i 30 godina. „To znači da i nije baš nemjerljivo dugo do trenutka kada više nećemo trebati srce donora, više nam neće trebati donorska jetra“, kaže Dvir. „Možda jesam jako optimisličan, ali mislim da ćemo za manje od 20 godina u sebi imati organe 3D-ispisane od naših vlastitih stanica. To je realitet, znanost na djelu, a ne znanstvena fantastika.“

^{Igor „Doc“ Berecki je pedijatar-intenzivist na Odjelu intenzivnog liječenja djece Klinike za pedijatriju KBC Osijek. Pobornik teorijske i praktične primjene medicine i znanosti temeljene na dokazima, opušta se upitno ne-stresnim aktivnostima: od pisanja znanstveno-popularnih tekstova i objavljivanja ilustracija u tiskanom izdanju časopisâ BUG, crtkanja računalnih grafika i primijenjenog dizajna, zbrinjavanja pasa i mačaka, fejsbučkog blogiranja o životnim neistinama i medicinskim istinama, sve do kuhanja upitno probavljivih craft-piva i sasvim probavljivih jela, te neprobavljivog sviranja bluesa.}