Kad su 2012. godine Jennifer Doudna i Emmanuelle Charpentier predstavile metodu CRISPR/Cas9 (za što su 2020. dobile i Nobelovu nagradu za kemiju), znanstveni je svijet oduševljeno zaključio kako je pronađen sveti gral genetičkog inženjerstva: jednostavan i pristupačan laboratorijski alat kojim je moguće „krojiti“ DNK – prerezati ju točno gdje treba i na tom mjestu ugraditi promjene po želji – jednostavno, brzo, jeftino... gotovo čarobno.

Precizno rezanje (bez krvi i suza)

U stvarnosti je, međutim, CRISPR-magija uskoro počela pokazivati i svoje manje pozitivne strane: krojenje i mijenjanje DNK znalo je ponekad naciljati na pogrešne mete, pa uzrokovati neželjene mutacije - s posljedicama koje je teško predvidjeti, kontrolirati i korigirati. CRISPR je bio ingeniozan i učinkovit genetski skalpel – ali je ponekad činio grube, pa i pogrešne rezove.

Desetljeće kasnije, znanstvenici s Massachusetts Institute of Technology (MIT) predstavili su poboljšanu verziju jednog od CRISPR-ovih nasljednika, nazvanog prime editing, koji obećava gotovo besprijekornu preciznost. Njihova modifikacija proteina uključenih u taj proces smanjuje učestalost pogrešaka i desetke puta, bez povećanja složenosti cijelog sustava. Drugim riječima, alat postaje točniji – a pritom ne i kompliciraniji.

Inovativnu tehnologiju prime editinga opisali su prošloga mjeseca u časopisu Nature u radu naslovljenom „Engineered prime editors with minimal genomic errors“. Kako je opisao jedan od recenzenata, u svijetu genetičkog inženjerstva to znači kao da je pronađen način da kirurški skalpel posve samostalno obavlja operaciju, a da pritom ne izazove neželjeno krvarenje niti prereže bilo što nepotrebno.

Kako se uređuje život: od Cas9 do prime editora

Da bismo razumjeli što su znanstvenici s MIT-a zapravo učinili tako inovativno, treba se nakratko vratiti na početak priče, na osnove CRISPR-editiranja gena. Krenimo od temeljnih pojmova: geni (i oni normalni, "zdravi", baš kao i oni koji su iz bilo kojeg razloga patološki izmijenjeni) nalaze se ugrađeni u slijed kodova upisanih u kromosome, na DNK. Geni su ustvari svojevrstan blueprint - građevinske i inžinjerske „poruke“ koje nose upute za rad i funkciju svih stanica u organizmu, a te poruke (iz DNK do izvršnih mjesta) donose i odnose male molekule - glasničke RNK.

Klasični CRISPR/Cas9 sustav funkcionira poput biološkog GPS-a s ugrađenim nožem za izrezivanje dijelova DNK: molekula-vodič (u ovom slučaju RNK) pronađe točno mjesto gdje treba intervenirati na DNK, a enzim Cas9 ima ulogu noža koji prereže obje niti dvostruke DNK-zavojnice. Nakon toga sustavi za popravak DNK (koje stanica prirodno posjeduje) pokušavaju „zakrpati“ nastali rez – i tu se otvara prostor unutar kojega ponekad može nastati pogreška i posljedično tome - cijela drama.

Naime, CRISPR/Cas9 popravci su relativno često popraćeni pogreškama: povremeno se dogode neželjena umetanja, brisanja ili zamjene „slova“ genetskog koda na prerezanoj DNK. Iako to može biti korisno kad želimo trajno onesposobiti neki nepoželjni gen, može biti vrlo riskantno ako pogrešan gen ne pokušavamo samo ukloniti i isključiti, nego ga želimo nadomjestiti, zamijeniti „ispravnim“, odnosno posve popraviti mutaciju koja uzrokuje neku bolest. Riskantno je – jer pored već postojeće genske bolesti možemo (ubacivanjem pogrešnog koda) izazvati još jednu gensku pogrešku ili čak potaknuti mutacije koje dovode do nastanka karcinoma.

Prime editing - nježniji i precizniji način korekcije genskih grešaka

S druge se strane nalazi već godinama poznata tehnologija prime editinga, koja donosi znatno sofisticiraniji pristup: umjesto da Cas jednostavno prereže oba lanca DNK kao kod CRISPR-postupka, prime editing koristi modificirani Cas, enzim koji „zareže“ samo jednu stranu lanca, a potom pomoću prethodno stvorene RNK šablone (tzv. pegRNK) na ciljano mjesto upiše željenu promjenu genskog koda. Razlika između CRISPR-a i prime editinga je poput razlike između korekcije teksta napisanog na pisaćem stroju i teksta u računalnom programu za editiranje: promjena u rečenici je moguća bez da se oštećuje ili čak potrga cijeli papir. Na taj način je prime editing omogućavao da se izbjegnu mnoge neželjene mutacije. Ali, ni njegove prve verzije nisu bile savršene – sve do ove nove, koju su MIT-ovci predstavili u svojem radu.

Oni su uspjeli precizno „podesiti“ enzime unutar sustava prime editora, čime su učestalost pogreške pri ispravljanju DNK-sekvencije smanjili s jedne pogreške u sedam izmjena na DNK-lancu (skoro 15%) na svega jednu u stotinjak slučajeva (dakle na 1%), a u novijim eksperimentalnim postavkama čak i na jednu u pet stotina (0,2%). Drugim riječima: postignuta je preciznost „rezanja i krojenja“ gena u DNK kakvu bi poželio i najpažljiviji kirurški robot.

Od izrezivanja do prepisivanja

Treba naglasiti da je CRISPR/Cas9 vrlo učinkovit, ali prilično grub alat – svojevrsna genetska „motorna pila“ – dok se prime editing ponaša poput preciznog laserskog skalpela: umjesto okrutnog reza u oba lanca DNK, on reže i zamjenjuje samo željeni dio na jednom lancu, a posao daljnje korekcije DNK potom prepušta molekularnim mehanizmima prepisivanja i kopiranja genskog koda koji su prirodno prisutni u stanicama.

Dakle, prime editing je preciznija i sigurnija genska tehnologija koja omogućuje izmjene bez izazivanja „panike“ u staničnim mehanizmima popravka DNK. Zauzvrat, tehnički je zahtjevniji od CRISPR-a: potrebno je pažljivo dizajnirati RNK-šablonu, optimizirati enzime i kontrolirati proces kako bi sve prošlo bez neželjenih nuspojava. MIT-ov rad upravo to poboljšava: preciznost raste, a rizici padaju.

Znanstvenici se nadaju da će ovakvi napreci otvoriti vrata terapijskim primjenama kod nasljednih bolesti, onih koje su posljedica jedne točkaste mutacije u DNK. U teoriji, prime editing bi mogao ispraviti grešku u genu poput pravopisne pogreške – trajno i točno.

Nova generacija: R‑Cas9 i R‑IscB – genetska poezija u pokretu

Ali – kako bi rekli u onim iritantnim TV-shop reklamama – to nije sve! Ni klasična CRISPR/Cas9 metoda nije razočarano kapitulirala i položila oružje kada se pojavio precizniji konkurent za ispravljanje genskih pogrešaka. Paralelno s razvojem sustava koji se oslanja na DNK alate, pojavila se i nova generacija CRISPR-a koja je usmjerena na – RNK. Umjesto da trajno uređuju genetski zapis time što će Cas9 presjeći DNK-lanac i iz njega „izbaciti“ neželjeni gen, znanstvenici sada rade s alatima koji funkcioniraju samo na razini genskih poruka koje RNK-glasnici prenose iz gena (tj. iz DNK) u stanice, pritom ne mijenjajući sadržaj tih poruka nepovratno, nego privremeno i reverzibilno.

Sustavi poznati kao R‑Cas9 i R‑IscB predstavljaju evolucijske potomke Cas9 enzima, preoblikovane tako da prepoznaju i mijenjaju RNK umjesto DNK.

Kako to rade? R-Cas9 i R-IscB funkcioniraju kao precizni „molekularni prevoditelji“ koji prepoznaju i ispravljaju poruke unutar RNK – točnije, unutar glasničke (messenger), mRNK. Umjesto da ispravljaju genske pogreške tako što „režu i lijepe“ izravno na DNK, oni mijenjaju precizno određena „slova“ u sekvenci glasničke mRNK – što je privremena i reverzibilna promjena bez trajnog upisa u DNK sekvencu. Takve izmjene na razini mRNK ne mijenjaju samu DNK (dakle, uopće ne mijenjaju gene!), već mijenjaju sadržaj poruka koje geni iz DNK posredstvom glasničke mRNK šalju stanicama. A te izmijenjene poruke djeluju nekoliko tjedana ili mjeseci, pa se s vremenom spontano gube kako se mRNK molekule prirodno razgrađuju i obnavljaju.

Slikovito rečeno, DNK i dalje u sebi nosi „pogrešan“ gen koji izaziva bolest – ali R-Cas9 i R-IscB alati niti ne pokušavaju popraviti samu DNK, nego mijenjaju poruke koje ta „loša“ DNK šalje stanicama tako što umjesto originalne podvaljuju „popravljenu“ mRNK koja nosi ispravljenu, laboratorijski pripremljenu verziju genske upute. Stanice slušaju što im poručuje mRNK – i obavljaju svoj posao onako kako su im zadali znanstvenici, a ne onako kako je zapisano u genima.

DNK ili RNK editiranje – koja je razlika?

Ovakvo uređivanje RNK ima nekoliko ključnih prednosti. Promjene nisu trajne, što znači da znanstvenicima omogućuju promatranje i procjenu učinkovitosti terapije bez trajnih posljedica po genski kod zapisan u DNK. Drugo – i ne manje važno - eventualna pogreška kakva se događa u CRISPR-sustavima neće ostati trajno zapisana, već će trajati samo dok se mRNK ne razgradi. Nadalje, tehnološki gledano, ovi sustavi su u molekularnom smislu manji, što olakšava njihovu dostavu u stanice pomoću virusnih vektora ili nanotehnoloških kapsula. A to znači da se uspješna terapija „lažnim porukama“ može ponavljati koliko god puta je potrebno.

Naravno, i ova tehnologija je još u eksperimentalnoj fazi. No već sada se vidi potencijal za razvoj „mekših“ terapijskih pristupa: umjesto genetskog kirurga koji čvrstom rukom mijenja DNK-zapis „uklesan u kamenu“, posrijedi je biokemijski alat koji promjene u genskom kodu zapisuje na biorazgradivom papiru privremenom tintom koja će nakon nekog vremena izblijediti i nestati. Ukoliko se pak promjena pokaže korisnom, bit će moguće svakih nekoliko tjedana ili mjeseci ponoviti terapiju, novim „ubacivanjem“ mRNK koja nosi željenu ispravljenu poruku i prekriva posljedice pogrešnog zapisa u genima.

Od skalpela do tipkovnice: preciznost, sigurnost i etika

Kako alati postaju sve precizniji, pitanje „možemo li to?“ polako zamjenjujemo s onim „...a smijemo li?“. Svaka nova verzija CRISPR-a otvara i nova etička pitanja – od medicinskih terapija do mogućeg dizajniranja embrija. MIT-ova poboljšanja prime editinga usmjerena su prema sigurnijem korištenju u liječenju ljudi, ali se istodobno približavaju granici koja razdvaja liječenje od dizajniranja.

Primjene su goleme: nasljedne bolesti, imunoterapije, regenerativna medicina, pa čak i otporniji usjevi. No mogućnosti zlouporabe također su stvarne. Kad tehnologija postane dovoljno jednostavna, pitanje tko je koristi i zašto postat će važnije od same metode.

U samo desetak godina, genetsko editiranje prešlo je put od grubog reza do gotovo poetske preciznosti. CRISPR/Cas9 pokazao je da možemo mijenjati DNK, prime editing je dokazao da to možemo činiti pažljivo, a R‑Cas9 i R‑IscB daju naslutiti da ćemo uskoro moći uređivati i same poruke života – mRNK – s elegancijom i bez straha od trajnih posljedica.

Ako su geni tekst života, znanost upravo uči kako ga tipkati bez grešaka. A to - u ovom kontekstu - znači da bi sljedeće poglavlje biotehnologije (uz dužni etički oprez) moglo biti ne samo čitljivije, nego i sigurnije nego ikad prije.

^{Igor „Doc“ Berecki je pedijatar-intenzivist na Odjelu intenzivnog liječenja djece Klinike za pedijatriju KBC Osijek. Pobornik teorijske i praktične primjene medicine i znanosti temeljene na dokazima, opušta se upitno ne-stresnim aktivnostima: od pisanja znanstveno-popularnih tekstova u tiskanom i online-izdanju časopisâ BUG, crtkanja računalnih i old-school grafika i dizajna, zbrinjavanja pasa i mačaka, fejsbučkog blogiranja o životnim neistinama i medicinskim istinama, sve do kuhanja upitno probavljivih craft-piva i sasvim probavljivih jela, te neprobavljivog sviranja bluesa.}